بررسی نقش سیگنال پپتید phoa بر بیان پری پلاسمیک دسیرودین(هیرودین) در e.coli

با توجه به مزیتهای دارویی هیرودین و ارجحیت مصرف آن در مقایسه با هپارین بعنوان داروی ضد انعقاد، تولید آن در داخل کشور برای مصارف دارویی امری ضروری می باشد. بدست آوردن مقادیر زیاد هیرودین از منابع طبیعی بسیار مشکل بوده، بنابراین استفاده از تکنولوژی تولید پروتئینهای نوترکیب اجتناب ناپذیر می باشد.هیرودین یک پروتئین کوچک با 65 تا 66 اسید آمینه می باشد که از غدد بزاقی زالو ترشح میگردد. هیرودین قوی ترین بازدارنده ترومبین می باشدو بعنوان یک داروی ضد انعقاد می تواند در بیماریهای قلب و عروق و عمل های جراحی مورد استفاده قرار گیرد و خطرات ناشی از لخته شدن خون را که غالبا به مرگ می انجامد کاهش دهد. از طرفی بیان بالای هیرودین برای سلول میزبان (e. coli) توکسیک بوده که برای حل آن استفاده از سیستم های ترشحی به منظور ترشح پروتئین هدف در دستور کار ما قرار دارد. بعلاوه هنگامیکه میزان بالایی از پروتئینهای هترولوگوس در e.coli بیان میشوند روند طبیعی فولدینگ مختل میشود؛ در اینحالت پروتئین تولید شده دارای ساختار سوم طبیعی نبوده و در نتیجه فعالیت بیولوژیک خود را از دست میدهد ، همچنانکه نمیتواند از سلول ترشح شود.لذا برای تولید هیرودین نوترکیب دارای سیگنال پپتید phoa این مراحل را انجام دادیم: 1- در مرحله اول سفارش ساخت ترادف 66 نوکلئوتیدی واریانت hv3 ژن هیرودین (فرم دسیرودین) آنرا به شکل سنتتیک دادیم. 2- سپس انتقال ژن به یک وکتور بیانی قوی (مثل وکتورهای خانواده pet) . 3-به منظور تسهیل در تخلیص این پروتئین، استفاده از his-tag در انتهای n ژن . 4-درج سیگنال پپتید phoa در ابتدای ژن هیرودین با هدف ترشح آن به فضای پری پلاسمیک باکتری و محیط کشت. 5- بیان پروتئین توسط سویه های bl21(de3)، origamib(de3) و اندازه گیری میزان بیان هیرودین توسط هر یک از سویه ها. 6- در مرحله بعدی میزان محصول تولید شده در درون سیتوپلاسم، فضای پری پلاسمی و محیط کشت انداره گیری شد.